2 테스트 절차
2.1 HPLC에 의한 동정
참고 릴리스 사양에 나열된 경우에만 이 테스트를 수행하십시오.
시료와 비교 물질의 머무름 시간의 원리 비교
방법 HPLC를 통한 관련 물질 참조(면적 정규화)
크로마토그램 HPLC를 통한 관련 물질 참조(영역 정규화)
평가 시료와 비교 물질의 크로마토그램에서 주요 피크의 머무름 시간을 비교합니다. 머무름 시간 간의 차이를 분 단위로 계산합니다.
차이(최소) = - RT초 - RTCS -
평가/평가 기준은 사양서에 명시되어 있습니다.
크로마토그래피 적합성 평가에 머무름 시간 요구 사항이 포함된 경우 확인을 위한 머무름 시간 평가에도 동일한 허용 기준이 활용됩니다.
RTss 시료 용액의 주요 피크 유지 시간
RTcs 비교 용액의 주요 피크 유지 시간
2.2 HPLC에 의한 관련 물질(면적 정규화)
UV 검출 기능을 갖춘 원리 RP HPLC
면적 % 평가
시약
물 예: 밀리-Q-장비
아세토니트릴 구배 등급, 예: 시그마-알드리치 34851
오르토-인산 85% 예: 플루카 79606
용매 아세토니트릴/물, 50:50(v/v)
500mL 아세토니트릴과 500mL 물을 혼합합니다.
비교 물질 현재 비교 물질 배치:
• N-tert-부톡시카보닐-N-메틸-L-알라닌
• N-tert-부톡시카보닐-L-알라닌
장비
장치 예: 애질런트 1200 HPLC
컬럼 Zorbax SB-C18
길이 150 mm, 내부 직경 3.0 mm 또는 이에 상응하는 컬럼, 입자 크기: 3.5 µm
참고: 컬럼의 치수(최대 변경: 컬럼 길이 ± 70%, 내부 직경 ± 25%) 및 입자 크기(최대 변경 - 50%)는 시스템 적합성 테스트 요구 사항이 충족되는 한 변경될 수 있습니다(허용된 변경 값은 Ph Eur 2.2.46에서 가져옴).
테스트는 각 샘플을 개별적으로 복제합니다.
크로마토그래피 조건
이동상 A 물 중 0.1% H 3 PO 4
물 1000mL에 85% 오르토-인산 1mL를 피펫팅합니다.
이동상 B 아세토니트릴
기울기 시간 [분] 위상 B [%]
0 10
10 45
15 95
20 95 취득 종료
20.1 10
30 10 다음 주입 (런타임)
유속 0.5mL/분
검출 UV 210nm
온도 30°C
주입량 5μL
SST 매개변수
특이성을 위한 특이성 솔루션
보고한도(=LOQ) 0.10%
SST 요구 사항
특이성 특이성은 비교 크로마토그램의 특이성과 동일해야 합니다(그림 5-2 참조).
보고 한계(= LOQ) 신호-대-잡음 비율은 10보다 크거나 s rel ≤ 15%여야 합니다(LOQ 용액에서 N-tert-부톡시카보닐-N-메틸-L-알라닌의 피크 면적, n = 3).
참고: 5개 이상의 샘플 용액이 주입되거나 SST 후 시퀀스 런타임이 5시간보다 긴 경우 SST는 시퀀스 끝에서 반복되어야 합니다.
테스트 절차
주입 순서 예 1: 공백, LOQ(1x 또는 3x), 특이성 용액, 비교 용액*, 샘플 용액(최대 5개)
예 2: 공백, LOQ(1x 또는 3x), 특이성 솔루션, 비교 솔루션*, 샘플 솔루션(5개 이상), LOQ(1x 또는 3x), 특이성
*"5.2 HPLC에 의한 식별"과 결합해서만 필요함
시료 용액 시료 120-130mg을 정확하게 0.1mg까지 칭량하여 25mL 용량 플라스크에 넣고 용해시킨 다음 용매로 희석합니다.
비교 솔루션(HPLC를 통한 식별에만 해당)
N-tert-부톡시카보닐-N-메틸-L-알라닌 비교 물질 48-52mg을 정확하게 0.1mg까지 칭량하여 10mL 용량 플라스크에 넣고 용해시킨 후 용매로 희석합니다.
LOQ 용액 25μL의 시료 용액을 용매로 25mL로 희석합니다.
특이성 용액 N-tert-부톡시카보닐-L-알라닌 비교 물질 8-10 mg을 10 mL 용량 플라스크에 넣고 녹여 시료 용액으로 부피를 희석합니다.
피크 면적비(면적%)로 평가
시료 용액 크로마토그램 보기(그림 2-1 참조)
그림 2-1 공백(I), LOQ 용액(II), 시료 용액(III) 및 특이성 용액(IV)의 오버레이 크로마토그램
2.3 키랄 HPLC에 의한 거울상이성질체 순도(면적 정규화)
원리 UV 검출 기능을 갖춘 키랄 RP HPLC
면적 % 평가
시약
물 예: 밀리-Q-장비
아세토니트릴 구배 등급, 예: 시그마-알드리치 34851
오르토-인산 85% 예: 플루카 79606
용매 아세토니트릴/물, 50:50(v/v)
500mL 아세토니트릴과 500mL 물을 혼합합니다.
비교 물질 현재 비교 물질 배치:
• N-tert-부톡시카보닐-N-메틸-D-알라닌
• N-tert-부톡시카보닐-N-메틸-L-알라닌
장비
장치 예: 애질런트 1200 HPLC
컬럼 Daicel chiralcel OJ-RH
길이 150 mm, 내부 직경 4.6 mm 또는 이에 상응하는 컬럼, 입자 크기: 5 µm
참고: 컬럼의 치수(최대 변경: 컬럼 길이 ± 70%, 내부 직경 ± 25%) 및 입자 크기(최대 변경 − 50%)는 시스템 적합성 테스트 요구 사항이 충족되는 한 변경될 수 있습니다(허용된 변경 값은 Ph Eur 2.2.46에서 가져옴).
테스트는 각 샘플을 개별적으로 복제합니다.
크로마토그래피 조건
이동상 A 물 중 0.1% H 3 PO 4
물 1000mL에 85% 오르토-인산 1mL를 피펫팅합니다.
이동상 B 아세토니트릴
등용매 분리 B = 20%
실행 시간 20분(=획득 시간)
유속 0.5mL/분
검출 UV 210nm
온도 30℃
주입량 10μL
SST 매개변수
특이성을 위한 특이성 솔루션
보고한도(=LOQ) 0.10%
SST 요구 사항
특이성 특이성은 비교의 특이성과 동일해야 합니다.
크로마토그램(그림 5-3 참조)
보고 한계(= LOQ) 신호-대-잡음 비율은 10보다 크거나 s rel ≤ 15%여야 합니다(LOQ 용액에서 N-tert-부톡시카보닐-N-메틸-L-알라닌의 피크 면적, n = 3).
참고: 5개 이상의 샘플 용액이 주입되거나 SST 이후 시퀀스의 런타임이 5시간보다 긴 경우 SST는 시퀀스 끝에서 반복되어야 합니다.
테스트 절차
주입 순서 예 1: 공백, LOQ(1x 또는 3x), 특이성 용액, 샘플 용액(최대 5개)
예 2: 공백, LOQ(1x 또는 3x), 특이성 솔루션, 샘플 솔루션(5개 이상), LOQ(1x 또는 3x), 특이성
시료 용액 시료 120-130mg을 정확하게 0.1mg까지 칭량하여 25mL 용량 플라스크에 넣고 용해시킨 다음 용매로 희석합니다.
LOQ 용액 25μL의 시료 용액을 용매로 25mL로 희석합니다.
피크 면적비(면적%)로 평가
그림 2-1 특이성 솔루션의 크로마토그램